水稻是世界上一半以上人口的主食作物，稻米的营养价值在饮食中具有非常重要的地位，因此将水稻开发成具有保健作用的功能性产品是势在必行的。功能型水稻是指富含特殊的营养成分，且食用后能改善人体生理功能的新型水稻品种或组合，同时这些水稻品种中的营养物质具有稳定遗传特性(廖江林等, 2003)。目前，富含维生素、抗性淀粉和某种氨基酸等功能型水稻品种已相继被选育出来，食用这些功能水稻可以有效改善维生素缺乏、缺铁性贫血症等营养缺乏症状，同时也可以预防一些高血压和糖尿病等疾病(陈光等, 2005; 朱秀灵等, 2005; 刘仲华等, 2007; 张祥喜等, 2007; Englyst et al., 2010)。紫宝香糯1号是江西省玉山县特种水稻研究开发中心育成的紫色功能稻，是当前世界上第一个栽培稻内源基因型含天然维生素A的水稻品种，VA含量为11 IU/100g，其基因是天然无公害优质基因，也是维生素A合成相关的优质基因(刘克琦等, 2010a; 2010b)。目前利用紫宝香糯已开发出系列功能性食品，产生了显著的社会和经济效益。因此，利用分子技术对维生素A相关基因进行分离克隆，并将相关基因用于改良和培育富含天然维生素A的营养保健型食用新品种，是一项为人类造福的事业。

QTL定位和图位克隆作为数量性状相关基因克隆的有效方法，已经在许多作物重要性状研究中发挥重大作用。QTL定位一般需要合适的群体和分子标记，同时要选择恰当的定位分析方法和工具。重组自交系(RIL)群体作为QTL初步定位的群体，是F₂个体通过单粒传或单穗传方式自交多代(5代以上)，杂合位点不断分离重组纯合获得。RIL群体作为一种永久保存群体，群体一旦构建成功，并对各家系基因分型后，可以同时多地多年考察研究多个性状。

本研究用紫宝香糯1号与93-11正反交，测定其F₁及F₂群体各株系维生素A含量，对紫宝香糯1号维生素A性状进行遗传分析。同时以紫宝香糯1号为母本，明恢63为父本构建了RIL F₅代群体，测定各家系的维生素A含量；并利用SSR引物对每个家系进行基因分型绘制遗传图谱；最终将基因型与表型性状结合初步定位维生素A合成相关QTL，为水稻含维生素A性状的精细定位与克隆提供依据。

1结果与分析

1.1紫宝香糯1号维生素A性状的遗传分析

由紫宝香糯1号做母本，93-11做父本杂交和93-11做母本，紫宝香糯1号做父本杂交分别获得F₁代种子，同时用紫宝香糯1号/93-11杂交F₁代产生F₂群体，通过对双亲和杂交后代的维生素A含量分析检测发现，紫宝香糯1号维生素A含量为10 IU/100 g，93-11含量为0，紫宝香糯1号/93-11 F₁代和93-11/紫宝香糯1号F₁代含量都为0。F₂代群体含量变化比较大，含量最高达到233.87 IU/100 g，最低为0。F₂群体一共200个家系，其中含有维生素A的单株数为30，其余170株含量为0，分离比例为5.67，不符合孟德尔遗传分离比例。分析表明，维生素A合成是隐性核基因控制的数量性状。

1.2 RIL群体遗传图谱构建和含维生素A的性状相关QTL定位

选取RI5代重组自交系中种子量足够的153个家系，与亲本紫宝香糯1号和明恢63一起进行维生素A含量检测，检测结果情况分布(图1)。其中亲本紫宝香糯1号含量为10 IU/100g，明恢63含量为0。RI5代重组自交系群体中有111个家系检测含有维生素A另外有42个家系不含维生素A。水稻糙米中维生素A含量呈现向低含量的偏态分离(图2)，各家系的含量处于两亲本之间，并且呈连续分布。该结果表明，水稻糙米维生素A含量由多基因控制。

图 1 重组自交系群体糙米维生素A含量的分布 注: ZBXN: 紫宝香糯1号; MH63: 明恢63 Figure 1 Vitamin A content distribution for recombinant inbred lines group Note: ZBXN: Zibaoxiangnuo 1; MH63: Minghui 63

图 2 完备区间作图法定位维生素A含量QTL的图谱 Figure 2 Graph of mapping QTL for vitamin a content using ICIM method

1.3维生素A性状QTL定位

利用QTL IciMapping 4.0对200个家系的带型进行分析，构建了一个包含156个标记的遗传图谱(图3)；其中总图距约1084.91 cM，标记间图距范围为0.27~27.95 cM，平均间距7.53 cM。所构建图谱可以满足QTL定位要求，并且与已经公布的水稻高密度遗传图谱一致性较好。

图 3 RIL群体维生素A含量的QTL定位图谱 注: 红色标注代表水稻维生素A相关QTL Figure 3 Map Locations of QTLs associatied with vitamin A content of RIL populations Note: Red indicates the QTL associated with vitamin A

利用QTL IciMapping 4.0软件，采用完备区间作图法(ICIM)对RIL群体各家系糙米的维生素A含量进行QTL定位分析。最终在第5和6号染色体上共找到3个水稻维生素A相关QTLs (表1; 图2; 图3)，并依据McCouch水稻命名方法，分别命名为qVA5、qVA6-1、qVA6-2，对表型变异的贡献率分别为9.25 %、18.95 %、8.99 %，3个QTL共同解释的表型变异为37.19%。其中位于6号染色体RM3187-RM3827间的qVA6-1的贡献率为18.95 %，为主效QTL，增效基因来源于紫宝香糯1号；位于5号染色体RM169-RM289间的qVA5和6号染色体RM162-RM528间的qVA6-2的增效基因来源于明恢63。

表 1 紫宝香糯1号/明恢63 RIL群体维生素A合成相关QTL定位 Table 1 QTL mapping about vitamin A content for Zibaoxiangnuo 1/ Minghui 63 RIL group

2讨论

为了让主要的粮食作物水稻富含维生素A，解决人类缺乏维生素A的问题，德国、瑞士、英国等不同国家的科学家(Ye et al., 2000; Beyer et al., 2002; Paine et al., 2005)，通过将外援胡萝卜素合成基因转入水稻中，获得胚乳含胡萝卜素的转基因品系，人们通过食用含胡萝卜素的稻米，在体内将胡萝卜素转换成维生素A。然而本研究的地方品种紫宝香糯1号自身就含有维生素A，因此，人们可以直接食用该品种来补充体内的维生素。另外研究者还发现在不同种植地区对紫宝香糯1号维生素A含量的影响不大(刘克琦, 2011)。杨玉梁等(2013)人研究发现，紫宝香糯l号维生素A合成相关基因在后代中能够稳定表达，并且在不同品种间可以通过杂交的方式进行转移。本试验利用紫宝香糯1号与不含维生素A的93-11正反交F₁代及F₂分离后代维生素A含量测定发现，紫宝香糯中维生素A含量是由隐形核基因控制的数量性状。

同时，本试验用于QTL定位的重组自交系群体与用于遗传分析的F₂代群体的维生素A含量分布存在较大差异，其中F₂代群体中含维生素A的家系占少数，而重组自交系群体中含维生素的家系占多数。从遗传角度来看，维生素A合成基因由隐形基因控制，F₂代群体许多家系还处于杂合状态，未表现出含维生素A的性状；RIL群体许多位点已经纯合，隐形性状可以表现出来。同时，由于F₂代群体是在浙江省食品质量监督检验站检测完成，检出线为2 IU/100g，RIL群体由江西省分析测试中心检测完成，2 IU/100 g以下也可以检测出来。对RIL群体维生素A含量的检测分析进一步证实，维生素A合成由隐性多基因控制。

目前关于维生素A相关的QTL还未见报道，但在维生素A原—类胡萝卜素合成相关基因和QTL的研究方面，人们已经获得了一些进展。研究者用甘蓝品种VI-158和BNC构建了一个F_2:3群体，通过SNP芯片分型构建了一张平均间距1.7 cM的高密度遗传图谱，利用两年的类胡萝卜素含量数据鉴定出3个相关QTL，可以解释50%以上的表型变异(Brown et al., 2014)。除此之外，还有研究者利用两个土豆二倍体群体通过全基因组QTL定位的方法，在3号染色体上找到了一个两群体共有的主效QTL，对土豆块茎类胡萝卜素含量变异的贡献率为71 %，但发现类胡萝卜素成分组成相关的QTL仅可以解释很小的变异(Campbell et al., 2014)；同时在其中一个群体中找到一个可以解释20 %变异的次主效QTL，位于9号染色体上；分析发现位于3号染色体上的QTL可能是一个编码β胡萝卜素羟化酶的基因，而位于9号染色体上的QTL可能是未知的类胡萝卜素合成基因(Campbell et al., 2014)。在玉米中，维生素A原生物合成相关基因已经有许多被定位和克隆，其中两个单拷贝基因PDS和ZDS分别被定位在1号和7号染色体(Hable et al., 1998; Matthews et al., 2003)，利用转座子标签技术定位并克隆了LCYB基因(Singh and Brutnell, 2003)。同时，研究发现玉米粒中类胡萝卜素水平与LCYE、crtRB1、PSY1基因的多态有关联，因此基于PCR的功能标记已经被开发出来用于含类胡萝卜素玉米品种的选育(Harjes et al., 2008; Yan et al., 2010; Zhou et al., 2012)。

本试验利用紫宝香糯1号与明恢63构建重组自交系群体，采用水稻基因组上公布的SSR标记对群体中200个家系进行基因分型，构建了一个总图距约1 084.91 cM，标记间平均间距为7.53 cM的遗传图谱。利用该图谱结合153个有表型的家系进行了QTL定位分析，检测到3个QTL，位于5和6号染色体上，其中位于6号染色体的qVA6-1，贡献率为18.95 %，为主效QTL，增效基因来源于紫宝香糯1号；另外两个QTLs对表型变异的贡献率分别为9.25 %、8.99 %，增效基因来源于明恢63。由此结果，可以在以后研究中进一步扩大群体，对主效QTL所在区间加密标记，找到紧密连锁的标记，用于精细定位和辅助育种。另外，本试验中检测到的维生素A含量高的家系可以作为育种中间材料，用于选育富含维生素A的高产优质新品种。

3材料与方法

3.1试验材料及群体构建

利用江西省玉山县特种水稻研究开发中心提供的富含维生素A功能稻紫宝香糯1号，以及不含维生素A品种93-11和明恢63作为亲本材料。连续三年在南昌和三亚两地穿梭种植群体构建材料，田间种植株行距为16.7 cm×20 cm，全部采用单本插秧。田间管理肥水管理参照当地大田生产进行(表2)。

表 2 试验材料构建时间计划 Table 2 Time plan for building experimental materials

用紫宝香糯1号和93-11进行正反交，分别收取F₁种子，用于检测维生素A含量和构建F₂代群体；F₂群体种植时采取种一株空两株的，待植株分蘖到10个左右，将其拔出拨成三株，再分三株重新插秧继续生长，待单株成熟收取所有种子用于检测维生素A含量。

以紫宝香糯1号为母本，明恢63为父本进行杂交，F₁代收取其中一株的种子(大约400粒)；将F₁代收获的种子全部播种，随机拔取200株苗种植，种子成熟后，每株只收主茎穗；F₃，F₄，F₅代播种时，将上一代收取的整穗直接种植(按照单穗种植方式)，每穗随机拔取一株苗种植；其中RI5代种植时采取种一株空两株的方式，待植株分蘖到6~10个左右，为了保障后续种子量，将其掰孽分三株重新插秧继续生长，待单株成熟收取所有种子用于留种和检测维生素A含量。

用516对引物对两亲本筛选，找出存在多态的引物用于RIL群体中各家系的基因分型。

3.2 PCR扩增及电泳分析

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法(Murray and Thompson, 1980) (略有改进)提取水稻分蘖期叶片DNA，-20 ℃保存。PCR扩增采用10 μL体系：1 μL 10×buffer，0.2 μL dNTP Mix (各2 mmol/L)，2 μL引物(F/R各2 μmol /L)，0.1 μL rTaq酶，1 μL DNA模板，ddH₂O补足至10 μL。PCR程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，设置35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物采用8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，电泳结果经0.1 %硝酸银染色，蒸馏水洗涤，1.5 % NaOH溶液显色后，观察带形。

3.3糙米中维生素A含量检测

将每个家系的材料从田间收取回来整理好，置于干燥处风干，保存于4 ℃冷柜中；当测定后代VA含量时，用砻谷机去除每个家系稻谷的米糠，得到糙米；然后用样品粉碎仪将糙米打成粉末。

所有亲本及后代材料的维生素A含量检测均参照《食品中维生素A和维生素E的测定》(中华人民共和国国家标准5009.82—2003)中维生素A检测高效液相色谱法的步骤，其检出线为2 IU/100 g，分别由浙江省食品质量监督检验站和江西省分析测试中心检测完成。

3.4遗传图谱构建和含维生素A性状相关QTL定位

根据两亲本基因型，分别读取RIL群体200个家系的基因型。对这些数据进行初步整理，利用中国农科院作物所王建康课题组开发的QTL IciMapping 4.0软件中MAP功能构建遗传图谱。

将RIL群体的维生素A含量数据与遗传距离数据整理到一起，导入QTL IciMapping 4.0，利用BIP功能的ICIM算法进行QTL分析。

作者贡献

周大虎、杜慧、谢薇和贺浩华是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，周大虎和杜慧完成数据分析，论文初稿的撰写；贺浩华和黎毛毛是项目的构思者及负责人，指导实验设计和数据分析；边建民、彭小松和傅军如参与实验设计，实验执行，论文修改和数据分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金(31360326)和江西省重大科技创新项目(2012ACB00500)共同资助。

参考文献

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